Контроль интактный. 56,4±0,6. Спустя 72 часа количество светящихся клеток. уже увеличивается более чем в 2 раза, и это сохранялось до 96 часов.


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте файл и откройте на своем компьютере.
УДК 619:616.28 Молекулярно - биологические механизмы противовирусного действия препарата лозеваль ОНИЩУК Филипп Давидович - ведущий научный сотрудник Краснодарского научно - исследовательского ветеринарного института, доктор биологических наук, профес сор. В статье приведены результаты молекулярно - биологических исследований препарата лозеваль и его активнодействующего компонента морфолиния в перевиваемой вируспродуцирующей культуре клеток павиана гамадрила. Ключевые слова: комплексная химиот ерапия, вирусно - бактериальные заболевания, респираторные инфекции, производные триазола, лозеваль , морфолиний , ДНК - полимеразы. Эффективность лекарственных препаратов в последнее время значительно снизилась из - за появления новых форм широко циркули р ующих в природе возбудителей резистентных к обычно применяемым лекарственным средствам. Возрастает роль новых инфекций, вызванных условно - патогенными микроорганизмами и вирусами. Болезни приобретают характер смешанных бактериально - вирусных инфекций. Все э то требует поиска и разработки новых химиотерапевтических средств с широким спектром действия – эффективных в борьбе с заразными заболеваниями различной этиологии. Для практической ветеринарии нами предложен оригинальный препарат лозеваль, являющийс я представителем новой группы химиотерапевтических средств – производных триазола, обладающий высокой лечебной и профилактической эффективностью. Активным противовирусным компонентом этого препарата является морфолиний - 3 - метил - 1,2,4 - триазолил — 5 - тиоацетат, проявляющий гепатозащитную и противовирусную активност ь . Предварительные исследования вирусингибирующей активности этого соединения на культуре клеток куриных фибробластов в отношении вируса гриппа типа А и в развивающихся куриных эмбрионах, инфицирова нных вирусом типа А и А2 показали, что при инфекционной активности вируса в 6 Lg ТЦД50 для клеток куриных фибробластов и 6 - 7 Lg ЭИД50 (эмбрион инфицирующая доза) для клеток эмбрионов кур, препарат лозеваль проявлял вирусингибирующее действие в отношении ви руса гриппа А (WSN) на 3,3 1g, а репродукция вируса штамм А (Англия) 42/72 на 4 1g. Аналогичные результаты были получены при изучении противооспенного и антигерпетического действия этого препарата . В связи с этим нами проведено изучение молекуляр ных механизмов противовирусного действия лозеваля и его активного компонента морфолиния в опытах in vitro на моделе вируспродуцирующей культуры 594 - S/F9 . С этой целью определялось их селективное воздействие на активность ДНК зависимых ДНК полимераз - клеточной и вирусной, а также экспрессию в них некоторых функций ассоциированного с клетками этой культуры герпесного вируса павианов ( ГВП). На первом этапе исследований была проведена синхронизация клеток культуры с целью одновременного вступления максимально большего количества их в митоз. Для этого через день после субпассажа к кул ьтуре, имеющей плотность 1 . 10 6 клеток/мл, добавляли 0,2 мг/мл раствор 12 - о - тетрадеканоилфорбол - 1,3 - ацетата /ТФА/ и ЦГ (циклогексамида) в ДМСО до концентра ции 20,0 нг/мл (оба раствора фирмы "Siqma"). Концентрация морфолиния и лозеваля соответствовала 1:10 ЛД 50. Клетки инкубировали в этой среде на протяжении 24 - 96 часов. К концу 3 - дневной синхронизации клетки дважды отмывали от несвязавшихся ТФА и ЦГ и помещ али в свежую среду с исследуемыми препаратами - известных блокаторов клеточной ДНК - полимеразы ТФА и, особенно, ИДУ, а также изучаемых нами морфолиния и препарата лозеваль. В результате проведенных исследований установлено, что в течение перв ых 24 часа скорость клеточной ДНК – полимеразы интенсивнее блокировалась , как и предполагалось, в присутствии ИДУ ( 9,1 %) и ТФА (34,8 % ). Морфолиний в этих условиях блокировал клеточную полимеразу на 39,7 %, а лозеваль на 40,2 % при 100% активности это го энзима в контроле . Спустя 72 часа блок синтеза клеточной полимеразы значительно ослабевал в присутствии ИДУ и ТФА и постепенно нормализовался в среде морфолиния и лозеваля . Следует отметить, что в этих условиях совсем по иному проявила себя вирусная ДНК - полимераза. В течении первых суток после удален ия из культуральной среды тормозящего клеточное деление ТФА+ЦГ наступает интенсивный синтез вирусной ДНК как в пробах с ТФА+ЦГ ( контроль сравнения), так и в среде индукторов синтеза вирусной полимеразы - ТФА ( 743,3 % ) и ИДУ ( 996,5 % ) в сравнени и со 100% интактным контролем. Напротив, скорость синтеза этого фермента в присутствии морфолиния составляла всего 2,5 % , а лозеваля - 2,1 %. К третьим суткам культивирования клеток в присутствии сравниваемых агентов активность вирусной полимеразы снизи лась вполовину с контролем в среде с препаратами сравнения ( ТФА и ИДУ) , в то же время в присутствии морфолиния и лозеваля этот блок еще более усилился ( табл. 1 ). Таблица 1. Активность вирусной ДНК - полимеразы в клетках культуры Индуктор 24 часа 7 2 часа имп/мин/10 3 клеток % имп/мин/10 3 клеток % Контроль интактный 56,4  0,6 100 53  5,2 100 Контроль после ТФА+ ЦГ 706,0  16,6 0,001 1176,6 24,6  2,5 0,02 46,4 ИДУ 598  10 0,001 996,5 7,0  0,6 0,001 13,2 ТФА 445,8  9,8 0,001 743,3 32,0  3,3 0,05 60 ,4 Морфолиний 1,4+0,09 0,001 2,5 0,45+0,002 0,001 0,7 Лозеваль 1,2  0,05 0,001 2,1 0,5  0,004 0,001 0,8 Полученные результаты согласуются с данными непрямой имуннофлуоресценции при люминесцентно - микроскопических исследованиях . Так установлено, что по сравнению с интактным контролем, где процент светящихся клеток в перевиваемой культуре не превышает 8,1 - 10,1, совместное внесение ТФА+ЦГ приводит к достоверному увеличению количества клеток с вирусными антигенами ( 12,8 - 13,3 % ) , что сохраняетс я и после удаления из среды этих агентов. Действие исследуемых препаратов на клетки, в которых был дополнительно индуцирован синтез вирусной ДНК - полимеразы различно. Так после первых 24 часов некоторое увеличение процента светящихся клеток отмечаетс я прежде всего в опыте с ИДУ, где скорость синтеза полимеразы увеличилась почти в 10 раз по сравнению с интактным контролем. Спустя 72 часа количество светящихся клеток уже увеличивается более чем в 2 раза, и это сохранялось до 96 часов. Сходные результ аты получены и в опыте с другим индуктором полимеразного синтеза - ТФА . Обратная картина наблюдалась в опытах с морфолинием и препаратом лозеваль. К 24 часам в их присутствии процент светящихся клеток по сравнению с контролем был идентичным, но к 72 ча сам количество клеток с вирусными антигенами снизилось почти в 3 раза в обоих опытах, и это сохранялось даже спустя 96 часов ( табл. 2 ). Таблица 2. Процент вируссодержащих клеток в реакции непрямой иммунофлуоресценции Индуктор 24 часа 72 часа 96 ч асов Контроль интактный 8,1  0,9 8,7  0,5 10,1  0,5 Контроль после ТФА+ ЦГ 12,8  0,5 0,02 13,3  0,9 0,02 12,7  0,7 0,05 ИДУ 14,9  1,2 0,02 17,6  0,6 0,01 20,1  0,8 0,01 ТФА 13,9  1,1 0,02 13,2  0,3 0,02 17,5  1,1 0,01 Лозеваль 7,9  0,8 0,5 3,4  1,5 0,05 4,1  0,4 0,05 Морфолиний 7,2  1,0 � 0,5 2,9  0,4 0,05 3,4  1,3 � 0,05 Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что препараты морфолиний и лозеваль селективно тормозят активность вирусной ДНК - полимеразы, при этом обратимо блокируя активность клеточной ДНК - полимеразы. Этим можно объяснить тот факт, что в опытах in vitro и in vivo , морфолиний и лозеваль обладают выраженным избирательным противовирусным эффектом. Практическая ценность препарата лозеваль подтверждена п оложительными результатами широких производственных испытаний. Наставление по применению его в ветеринарии утверждено Департаментом ветеринарии в установленном порядке. Препарат зарегистрирован Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзор у (N 000096 от 24.02.2011г.). Производство лекарственной формы лозеваль освоено ООО «Биостим». Широкие производственные испытания этого препарата показали, что он обладает бактериостатическими и бактерицидными свойствами по отношению к кишечной пало чке, золотистому стафилококку, сальмонеллам, стрептококку. Одновременно лозеваль проявляет выраженное противовирусное действие по отношению к вирусам - возбудителям оспы, вирусу гриппа А, вирусу инфекционного ларинготрахеита кур.

Приложенные файлы

  • pdf 85578058
    Размер файла: 251 kB Загрузок: 0

Добавить комментарий